荧光 PCR 即荧光定量聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。以下是其原理、主要类型和应用的详细介绍：
基本原理
荧光信号产生机制
荧光染料法：以 SYBR Green I 染料为例，它可以特异性地结合到双链 DNA 的小沟部位。在 PCR 反应过程中，随着双链 DNA 的不断合成，SYBR Green I 染料大量结合到新合成的双链 DNA 上，其荧光信号强度与双链 DNA 的数量成正比。通过检测荧光信号强度的变化，就可以实时反映 PCR 反应的进程。
荧光探针法：常用的 TaqMan 探针是一段与目标 DNA 序列特异性互补的寡核苷酸链，其 5' 端标记有荧光报告基团，3' 端标记有荧光淬灭基团。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号。在 PCR 延伸阶段，Taq 酶的 5'→3' 外切酶活性会将探针切断，使报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号，且荧光信号强度与 PCR 产物的数量呈正相关。
定量原理：在荧光 PCR 反应中，每个循环都会使目标 DNA 序列呈指数扩增。通过对荧光信号进行实时监测，当荧光信号强度达到设定的阈值时，所对应的 PCR 循环数被称为 Ct 值（Cycle threshold）。在一定范围内，起始模板量与 Ct 值呈对数线性关系，即起始模板量越多，Ct 值越小。通过已知浓度的标准品建立标准曲线，就可以根据未知样本的 Ct 值计算出其起始模板的含量。
主要类型
染料法荧光 PCR：除了前面提到的 SYBR Green I 染料法外，还有 EvaGreen 等染料也可用于荧光 PCR。染料法的优点是操作简单、成本较低，能对所有双链 DNA 进行染色，适用于对引物特异性要求不高、不需要区分不同目标序列的定量分析，如对基因组 DNA 总量的定量等。缺点是特异性相对较差，容易受到非特异性扩增产物的干扰。
探针法荧光 PCR：除 TaqMan 探针法外，还有分子信标、蝎型探针等。探针法的优点是特异性强，能准确地识别目标序列，避免非特异性扩增的影响，适用于对多个目标序列进行同时检测或对检测特异性要求较高的情况，如病原体的分型检测等。缺点是需要针对不同的目标序列设计特异性探针，成本较高，操作相对复杂。
应用领域
医学诊断
病原体检测：可用于检测病毒、细菌、真菌等病原体，如新冠病毒、乙肝病毒、结核杆菌等，实现疾病的早期诊断和病情监测。
肿瘤诊断与治疗监测：通过检测肿瘤相关基因的突变、扩增等情况，辅助肿瘤的诊断、分型和预后评估，还可用于监测肿瘤患者在治疗过程中肿瘤细胞的数量变化，评估治疗效果。
生物学研究
基因表达分析：定量分析不同组织、不同发育阶段或不同处理条件下基因的表达水平，研究基因的功能和调控机制。
遗传疾病研究：检测与遗传疾病相关的基因突变或基因拷贝数变化，为遗传疾病的诊断和发病机制研究提供依据。